ELISA（酶联接免疫吸附剂测定）是一种在免疫学研究中广泛应用的实验技术，主要用于检测抗原或抗体的浓度。它在免疫荧光和放射免疫技术基础上发展而来，提供了一种可靠的免疫测定方法。

显色过程

ELISA的显色是实验的关键步骤之一，涉及酶对无色底物的催化生成有色产物。反应的温度和时间显著影响着显色效果。一般来说，阴性孔在特定时间内保持无色，而阳性孔的颜色会随着时间的延长而加深。适当提高反应温度可以加速显色过程。在定量测定中，加入底物后的反应条件应严格按照方法要求进行。而在定性测定中，室温下的显色通常不需严格控制时间，且可以根据阳性和阴性对照孔的显色适当调整反应时间。

底物选择

在ELISA中，OPD和TMB是常用的显色底物。OPD底物在37℃下反应20-30分钟后显色达到峰值，再延长时间可能会导致背景值上升。应注意，OPD底物在光照下会自行变色，因此显色反应宜在避光条件下进行。当使用硫酸终止反应后，颜色会由橙黄色转为棕黄色。

TMB底物的显色时间较为稳定，可以在室温下操作，但为了确保实验结果的一致性，应在规定时间内读取结果。经过HRP催化后，TMB一般在40分钟达到最佳显色，随后会逐渐减弱，两个小时后显色可消退至无色。各种终止液，包括叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS），都可以有效终止反应，并保持较长时间的蓝色显色。

实验常见问题及解决方案

在ELISA实验中，常见的问题包括标曲不显色或显色弱、样本与标准曲线不一致等。以下是一些常见问题的分析及建议：

1. 标曲不显色或显色很弱

出现这一问题可能是由于标准品没有充分溶解或在稀释过程中没有充分涡旋震荡。确保标准品在溶解与稀释时均进行充分的搅拌，以提高溶解度和均匀性。

2. 标曲和样本均不显色

如果在孵育阶段静置在桌面上，会影响抗原与抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。建议使用ELISA专用的微孔板振荡器进行有规律的震荡，以增强抗原和抗体的结合。如果确认流程无误，但仍失败，可能漏加了某个组分，应作详查。

3. 标曲显色，样本不显色

当样本中的目标蛋白浓度极低或者有干扰成分存在时，ELISA可能检测不到。这是由于每种实验方法固有的灵敏度限制。在这种情况下，可以尝试使用高敏ELISA，但并不意味着一定能检测到目标蛋白，只有提高测定的可安全性。

4. 标曲和样本都显色，但复孔的CV大

如果复孔的变异系数（CV）较大，通常与移液器的使用不当和实验者的操作习惯有关。建议好好维护移液器，并在实际操作中加以练习，以确保每次加样的一致性。

总之，ELISA作为一种重要的检测方法，能够在生物医疗领域中发挥关键作用。结合环亚集团ag旗舰厅的高品质试剂盒，可以确保实验结果的准确性和可靠性，从而为后续研究提供有力支持。