细胞冻存是指通过将细胞置于低温环境中，以减少其代谢活动，从而实现长期保存细胞，以便后续进行实验或临床应用的目的。细胞冻存主要遵循慢冻原则，帮助细胞逐步脱水，避免因冰晶过大而造成的损害。

一、冻存原理

当温度降至-70℃时，细胞内的大部分代谢活动及酶活性几乎完全停止；低于-130℃时，细胞的存活率达到最佳状态。液氮被广泛用于实现细胞的长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能迅速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，同时提高细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少冰晶的生成，从而达到保护细胞的效果。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；

2. 用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化（此步骤同细胞传代操作）；

3. 消化后重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；

4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，最佳冻存密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，一般不低于5×10⁵/ml；

5. 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

6. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，并置于-80℃冰箱中过夜；

7. 最后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液轻轻吹吸均匀，转移至离心管；

2. 1000rpm离心3分钟，以收集细胞沉淀；

3. 使用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10⁶/ml，最低不低于5×10⁵/ml；

4. 完成分装后，确保冻存管盖子拧紧并做好标记；

5. 将冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱中过夜；

6. 之后，将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

① 细胞培养、传代及冻存操作需遵循严格的无菌规范。

② 在传代时需适度消化，消化时间受多种因素影响，应关注细胞形态变化，若出现胞质回缩或连接松散的现象，应及时终止消化。

③ 传代操作应在细胞处于对数期且尚未达到汇合状态时进行。

④ 冻存液需提前配置，切勿直接将DMSO加入细胞悬液中。

⑤ 冻存操作应选择汇合度为80%-90%且活力超过90%的细胞，以确保最佳状态，冻存密度可根据细胞特性进行调整。

⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液和完全培养基等试剂均需回温至室温备用。

⑦ 冻存前应注意避免消化时间过长、吹打力度过大、离心转速过高或离心时间过久，以免造成细胞损伤。

⑧ 确保冻存管盖子拧紧，以防水浴复苏时水分渗入导致污染。

⑨ 细胞不可长期存放于-80℃冰箱，存放时间不宜超过3天。

⑩ 液氮或冰箱与细胞房距离较远时，应在干冰或冰盒上运送细胞至细胞房。

通过遵循这些步骤和注意事项，可以有效保证细胞冻存的成功性，从而在临床和科研中为环亚集团ag旗舰厅的未来研究提供可靠的细胞资源。